免疫系统分析需要考虑的4个因素

为什么要进行免疫库测序?

适应性免疫依赖于身体识别和响应几乎无穷无尽的分子的能力，这是一项通过T细胞和B细胞受体（分别是TCR和BCR）实现的复杂功能。受体-抗原相互作用是特异性的，这意味着需要TCR和BCR的巨大多样性来识别可能遇到的各种各样的抗原。为此，适应性免疫系统进化出了一种体细胞多样化系统，通常称为V（D）J重组。最终，这一过程产生具有足够TCR和BCR多样性的细胞群体，以识别任何可想象的肽。然而，正是这种受体序列的多样性使得分析它们变得困难，从研究自身免疫疾病和癌症背后的机制到开发免疫治疗模型的无数研究应用都依赖于这第一步的成功。

如何分析免疫储备?

传统上，免疫系统谱分析依赖于克隆和Sanger测序或功能方法来识别抗原特异性(如四聚体检测/染色)。虽然这些方法产生了有价值的见解，但下一代测序(NGS)的持续发展极大地扩大了曲目谱分析研究的规模。除了在研究人员的工具包中添加的这项技术之外，还有几个关于如何继续进行研究的关键决策点。

在选择免疫系统序列方法时，我应该考虑哪些因素?

DNA与RNA模板

使用基因组DNA作为模板可以更容易地确定克隆型的相对丰度，因为每个细胞只有一个模板。然而，这是有代价的。因为每个细胞都有TCR或BCR转录本的多个拷贝，所以RNA-seq方法更为敏感。因此，使用RNA可以更全面地识别独特的受体变体，包括存在于极少数细胞中的受体变体。

另外，测序mRNA揭示了经过剪接和转录后处理的表达受体的序列，因此更有可能产生官能蛋白质。相比之下，基于DNA的方法不会以其翻译形式识别受体序列，并且不可避免地产生许多功能性无关的序列。此外，模板选择可以确定NGS库准备的选项（见下文）。

CDR3仅与全长序列

大多数免疫分析实验都集中在TCR和BCR序列的CDR3区域。CDR3区域包含抗原和受体之间相互作用的核心位点，因此是最可变的，因此这并不奇怪。然而，全长测序将包括受体的其他区域，包括CDR1和CDR2，它们在抗原受体结合和/或下游信号的亲和力中发挥作用。全长测序也使直接克隆和表达免疫序列研究中确定的受体变得更容易。这对于抗体治疗或T细胞治疗应用尤其重要。

体积分析vs.单细胞分析

选择使用散装或单细胞分析取决于您的实验目标。一般来说，免疫库多样性的分析往往依赖于批量方法，而侧重于识别特定抗原的TCR或BCR序列的研究则使用单细胞分析。批量分析可以在单个实验中取样更多序列，但这样做是以配对信息为代价的。功能性tcr由成对的α链和β链组成，而bcr则有成对的重链和轻链。因此，这种配对信息对于识别实际的TCR或BCR分子是必需的。由于单个T细胞或B细胞表达单个受体序列，单细胞分析使捕获序列和配对信息成为可能。然而，分析单个细胞通常会减少可分析的样本数量。研究人员通常从大量分析开始，在选择结合亲和性或其他感兴趣的表型后转移到单细胞。

NGS文库准备:多重PCR vs. 5 ' RACE

制备用于免疫分析的测序文库的最常见方法是多重PCR。多重PCR适用于DNA和RNA模板，通常由两轮PCR（cDNA合成后，如果使用RNA作为模板）。第一轮PCR扩增受体基因座，并加入称为第二轮的引发位点的已知序列，其中掺入了测序适配器和指标。然而，3'尤其是第一个PCR重叠位点的初步位点具有显着的序列分集，这意味着需要许多简并引物来扩增不同的TCR / BCR序列（参见下图中的右图）．当然，这也可以引入显着的PCR偏压，其中更效率地扩增与引物更类似的受体序列。

另一种方法是5 ' RACE (Rap一个mplification的cDNAEnds)结合半嵌套PCR(见下图左图)。该方法仅适用于RNA输入，但避免了多重PCR引入的偏倚问题。在cDNA合成过程中，逆转录酶(RT)将未模板化的核苷酸添加到cDNA第一链的5 '端。一个与这些非模板核苷酸互补的模板开关寡聚体然后与第一链cDNA杂交。这使RT能够切换模板并在5 '端合并适配器序列。接下来的两轮PCR使用这个适配器序列，而不是依赖于TCR或BCR cDNA中的简并引物。这极大地减少了PCR偏倚，并确保免疫系统谱反映了原始样本，而不是引物设计。此外，第二个PCR是半嵌套的，确保了高的靶向率，从而降低了测序成本。

两种测序文库制剂对免疫重新衰脱测序的比较。5 ' RACE，作为我们SMARTer TCR和BCR分析试剂盒总体工作流程的一部分，能够从mRNA中捕获全长受体序列，而不依赖于多个重叠的变异区域的简并引物。多重PCR可以使用DNA或RNA作为模板，但通常需要对样品进行特异性优化，以避免由于使用上述简并引物而产生的PCR偏倚。在测序文库示例示意图中，P5和P7为引物在文库制备过程中添加的Illumina flow细胞结合位点。图中所有的引物都显示为沿着模板的左箭头和右箭头。

---

我们利用上述5′RACE方法，为人类和小鼠样本开发了几种TCR和BCR分析试剂盒。要了解更多信息并查看数据，请浏览我们的免疫分析页面．如果您有任何关于选择合适的工具包的问题，为您的研究，请联系我们技术支持团队．