插入、删除和替换，哦，天哪!-设计位点诱变引物

你的突变方法在富含GC的模板中表现差吗？你得到的菌落是太少还是太多，没有你想要的突变，还是根本没有菌落？可悲的是，这些问题几十年来一直困扰着研究人员。

你会很高兴知道有一个解决方案，它开始和结束于“融合“In-Fusion是市场上性能最好的无缝克隆产品，但你知道你也可以使用该技术进行定点诱变吗?

融合内克隆产品提供了使用任何载体产生单个或多个碱基变化、删除和插入的灵活性，通过结合融合内克隆技术和高保真反向PCR（使用一种与富含GC的模板配合良好的聚合酶），精确度超过95%。

融合克隆定点突变的方案是什么？

在反向PCR在融合系统,引物是面向相反的方向上圆形的克隆载体(图1)。进行诱变,设计PCR引物,以便他们有15-bp相互重叠的5 '结束,将感兴趣的突变,并使用高保真PCR聚合酶等PrimeSTAR Max DNA聚合酶，它在富含gc的模板上显示出最小的错误率。

图1。利用融合技术进行诱变的程序。发生突变的区域用黄色表示。设计完实验后，在第1天执行方案(上面的第3步)，并在第2天恢复您的最终结构(上面的第4步)。注:虽然这里显示的所有例子都涉及蛋白质编码(基因)序列，但您可以使用相同的方法修改非编码序列，如启动子或转录因子。

想知道细节吗?看到我们的突变与融合克隆技术笔记！

如何设计位点定向诱变的In-Fusion引物?

我们的在线底漆设计工具只需输入载体和插入物的DNA序列，即可为定点诱变实验设计引物。它允许您指定要删除的确切核苷酸，在您想要的插入位点添加您选择的载体序列，输入替换序列(独立于限制位点)，并根据您的设计下载引物和PCR信息。使用我们的工具和下面的指导方针，注意可以使用专门的教程来设计初级生成器删除，插入，及替换．

底漆设计的一般指导原则

• 每个PCR引物应在圆形载体模板上以与另一引物相反的方向指导DNA合成。
• 正向和反向PCR引物的3'端应有18-25个nt，与模板互补，确保高效和特异性扩增。
• 突变应包含在位于正向和反向PCR引物5'末端的同源15 nt重叠处(这种同源重叠是突变载体的再循环所必需的)。
  • 单个或多个碱基的变化、缺失或插入可以在单个in - Fusion反应中引入。
  • 通过将正向引物和反向引物的3'端定位在缺失位点的边缘位置，也可以引入任意长度的更大的缺失，其中任何一个引物的5'端都带有同源的悬垂物。

由此产生的反向PCR将产生一个线性双链载体，其侧翼末端彼此互补，并携带15个核苷酸的同源重叠。这种重叠将通过熔合反应进行连接，并在熔合反应中恢复大肠杆菌从而产生突变的载体。反PCR扩增的载体可以用克隆增强子破坏亲代载体，直接用于in - fusion反应。

我如何从任何向量中删除一个特定的序列?

使用引物设计工具(在“项目类型”下选择“Mutagenesis”)和“删除序列”教程设计PCR引物:

• 删除选定向量中的特定基或序列
• 指定要删除的确切核苷酸
• 生成并下载设计的引物和PCR信息

如何将一个特定序列插入到任意向量中?

简单地使用工具与“插入序列”教程设计底漆以：

• 添加您选择的向量序列
• 选择插入位点(不依赖于限制位点)并指定要添加的确切核苷酸
• 根据你的设计下载引物和PCR信息

如何删除和替换任何向量中的序列？

再一次，用这个工具"在任意向量中删除和替换序列"教程设计底漆以：

• 添加您选择的向量序列
• 指定要删除的确切的核苷酸
• 输入替换序列
• 根据你的设计下载引物和PCR信息

有了In-Fusion的诱变，您现在有勇气和信心克服定点诱变的挑战，而且您永远不会回头使用这个强大的、精确的工具，使用您选择的载体进行更快、更容易、更准确的定点诱变。