插入、删除和替换，哦，天哪!-设计位点诱变引物

你的诱变方法在富含气相色谱的模板中表现不好吗?你得到的殖民地是太少还是太多，没有你想要的突变的殖民地，还是根本没有殖民地?可悲的是，这些问题已经困扰研究人员几十年了。

你很乐意知道有一个解决方案，它开始和结束“在融合。“融合是众所周知的，是在市场上表现最高的无缝克隆产品，但您是否知道您也可以使用该技术进行网站导向诱变？

In-Fusion Cloning产品提供了使用任何载体产生单个或多个碱基变化、缺失和插入的灵活性，准确率超过95%——通过结合In-Fusion克隆技术的力量和高保真反PCR，使用的聚合酶与富含gc的模板很好地工作。

融合克隆位点定向突变的协议是什么?

在反向PCR在融合系统,引物是面向相反的方向上圆形的克隆载体(图1)。进行诱变,设计PCR引物,以便他们有15-bp相互重叠的5 '结束,将感兴趣的突变,并使用高保真PCR聚合酶等樱草颗MAX DNA聚合酶，它在富含gc的模板上显示出最小的错误率。

图1所示。用In-Fusion技术进行诱变的程序。发生突变的区域用黄色表示。设计完实验后，在第1天执行方案(上面的第3步)，并在第2天恢复您的最终结构(上面的第4步)。注:虽然这里显示的所有例子都涉及蛋白质编码(基因)序列，但您可以使用相同的方法修改非编码序列，如启动子或转录因子。

想知道细节吗?看到我们的用融合克隆技术说明诱变！！

如何为网站导向诱变设计融合引物？

我们的在线底漆设计工具通过输入载体和插入的DNA序列，您可以让您为网站定向诱变实验设计引物。它允许您指定要删除的精确核苷酸，在所需的插入轨迹处添加您选择的矢量序列，输入替换序列（独立于限制站点），并根据您的设计下载底漆和PCR信息。使用我们的工具与下面的指导方针一起使用，注意到专门的教程可用于设计底漆以产生删除那插入,替换。

底漆设计的一般指导原则

• 每个PCR引物应在圆形载体模板上引导相反方向的DNA合成。
• 正、反PCR引物的3'端应与模板互补18-25 nt，以保证高效特异性扩增。
• 突变应纳入位于正向和反向PCR引物的5'末端的同源15-NT重叠内（这种同源重叠需要突变载体的再循环化）。
  • 单个或多基础变化，缺失或插入可以在单一的融合反应中引入。
  • 通过将正向引物和反向引物的3'端定位在缺失位点的边缘位置，也可以引入任意长度的更大的缺失，其中任何一个引物的5'端都带有同源的悬垂物。

逆转录聚合酶链反应将产生一个两侧末端互补并携带15 nt同源重叠的线性双链载体。这种重叠将通过In - Fusion反应结合起来，并在In - Fusion反应中恢复大肠杆菌,从而产生突变的载体。通过逆PCR扩增的载体可以用克隆增强剂治疗以破坏亲本载体并直接用于融合反应。

如何从任何向量中删除特定序列？

使用引物设计工具(在“项目类型”下选择“Mutagenesis”)和“删除序列”教程设计PCR引物：

• 删除选择的向量中的特定基础或序列
• 指定要删除的确切核苷酸
• 生成并下载设计的引物和PCR信息

如何将特定序列插入任何向量？

只需使用该工具“插入序列”教程设计入门：

• 添加您选择的矢量序列
• 选择插入基因座（独立于限制性位点）并指定要添加的精确核苷酸
• 根据您的设计下载PRIMER和PCR信息

我如何删除和替换任何向量中的序列?

再一次，使用该工具"在任意向量中删除和替换序列"教程设计入门：

• 添加您选择的矢量序列
• 指定要删除的精确核苷酸
• 输入替换序列
• 根据您的设计下载PRIMER和PCR信息

有了In-Fusion的诱变，您现在有勇气和信心克服定点诱变的挑战，而且您永远不会回头使用这个强大的、精确的工具，使用您选择的载体进行更快、更容易、更准确的定点诱变。