单克隆抗体已广泛用于各种研究和诊断目标，其中严格的抗原特异性是一个关键的关键点。另外，由于抗体工程（例如，嵌合和人源化抗体的发展）的组合和抗体生产技术的改进技术，直接使用单克隆抗体作为治疗治疗变得更加可行。

由于抗体 - 抗原特异性由抗体的可变区的特异性结构确定，因此该区域序列的分析是许多应用中的第一步，包括在无动物系统中的抗体产生，抗体作为药物的抗体，以及工程的生产抗体变异。具有智能cDNA合成技术和简化方法，聪明的赛车套件提供一种快速，简便的方法来分析这些可变和重要的核苷酸序列。

可变域序列分析的解决方案

免疫系统产生10^8.各种各样的抗体来抵御来自外部世界的入侵物质。这种多样性是通过在发育中的淋巴细胞中发生的V（D）J重组实现的。抗体分子具有重（H）和轻（L）链成分，具有恒定和可变（V）区域；V（D）J重组是可变序列与其他基因片段的几乎随机重排。这个过程产生独特的抗原受体。由于H和L链N端的可变区域决定抗体-抗原亲和力，因此对该区域的分析非常重要。

图1.碱性抗体结构。

在分析可变区域时，设计将扩增所有可能抗体序列的通用引物非常困难。H和L链上游5'末端的固有变异导致低序列同源性。分析这些可变域的有效方法是在可变区下游的恒定区域中设计一个退化的底漆，其中序列相对节省。然后可以使用5'播种来克隆目标区域（R.apid一种光化C脱氧核糖核酸E.Nds)方法，然后进行排序。智能RACE套件带来完整的5 '端信息和敏感性的这一过程。

比赛应用中智能技术的优点

利用智慧血液cDNA扩增试剂盒，在逆转录期间将较智能的II寡核苷酸加入到cDNA的末端。此过程包含我们独特的智能（S.巫婆m机狱一种在5 '末端R.NAT.（emplate）技术，允许逆转录酶到达转录本的绝对5′端。大多数其他RACE-PCR方法不能捕获5′端，因此错过了重要信息。此外，在5′端添加SMART序列使该位点能够用于下游扩增和克隆。对更智能的种族组件和协议的优化极大地减少了非特定背景并提高了放大效率。即使样本被基因组DNA污染，稳健的系统也能产生可靠的结果，适合广泛应用。用高保真聚合酶扩增cDNA片段可确保有效分析所需核苷酸序列的准确复制。

小鼠杂交瘤抗体基因的快速克隆

为克隆小鼠杂交瘤抗体基因，根据NCBI数据库中所有小鼠IgG类的序列，设计了H、L (κ)或L (λ)链的反转录引物(RT引物)和RACE PCR反转录引物(5 ' -RACE引物)。利用SMARTer RACE方法从总RNA中合成第一链cDNA，然后直接进行5 ' -RACE PCR，不仅可以获得5 '末端序列，还可以获得包含可变区全长序列的cDNA片段。

图2.使用智能血液cDNA扩增试剂盒的抗体可变域的5'-ram PCR的实验工作流程。

对小鼠杂交瘤株进行培养，证实产生了H链和L链分别由γ2a和κ链组成的单克隆抗体。总RNA的制备作为smart RACE cDNA Amplification Kit的输入。对重(H)链和轻(L)链均按照推荐方案进行cDNA第一链合成和5 ' -RACE PCR，并对部分反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳确认扩增产物。

然后，我们对六种另外的杂交瘤菌菌株进行相同类型的可变抗体区域的基因序列分析。PCR产物由所有抗体亚类获得。序列分析表明，90％的H克隆克隆和50％的L链克隆用于其各自的靶抗体蛋白的N-末端氨基酸序列精确编码。

图4。小鼠各亚类抗体基因的扩增．

在少数情况下，克隆对靶抗体具有序列同源性，但由于在其序列中存在止乳密码子存在而不太可能编码功能抗体。此外，我们怀疑一种特定的克隆含有来自用于细胞融合的骨髓瘤细胞的转录物，因为序列是从多个杂交瘤中获得的。一些杂交瘤与这种常见的序列产生更多的克隆，而不是靶单克隆抗体的序列编码。基于这些结果，显然应与DNA序列分析并联分析并确认靶抗体的N-末端氨基酸序列。

进一步改善智慧竞争cDNA合成，包括流线型克隆

为了提升竞赛程序，我们最近对我们更智能的赛车包进行了重大更新。用智慧族cDNA扩增试剂盒获得上面显示的数据，与PCR的PRAIGESTAR HS DNA聚合酶结合，以及用于连接克隆的强大克隆试剂设定（钝端）。从那以后，我们已经开发了智能RACE 5 ' /3 '套件，拥有同样独特的smart核心技术的完整系统，加上进一步的改进在反应条件和下游克隆中。

新的试剂盒包含了进行SMARTer RACE实验所需的所有组件(除了基因特异性引物)。通过将SMARTer II A寡核苷酸与SMARTScribe逆转录酶配对，它提供了高敏感性和特异性，以及低本底。SeqAmp DNA聚合酶提供了强大的PCR性能，在扩增长或富含gc的挑战性目标时尤其有用。

智能种族5'/ 3'套件的组件中的关键是融合高清克隆试剂盒，这使得无需使用连接酶即可轻松、准确地克隆5′种族片段。套件中提供了与融合技术兼容的线性化载体，所含引物专门设计用于匹配该载体。融合内克隆方法效率高，适用于所有克隆应用。通过将这项技术与成熟的更智能的竞争方法相结合，从RNA到克隆到分析只需两天时间。

智慧血细胞cDNA合成为抗体可变结构域的全长序列分析提供了一种敏感的流线型解决方案。这些可变区的多样性，同时对于有效的免疫反应至关重要，对研究人员来说，寻求分析这些基因段的研究人员对各种研究，包括药物发育。具有该序列使得可以改善的工程抗体在活的有机体内稳定性，具有改善的亲和力，或具有双重特异性。抗体可变区的评价是朝向这些和许多其他抗体修饰的第一步，并且更智能的5'-族PCR是用于克隆这些靶的用于测序目的的有效方法。

将7株小鼠杂交瘤菌株(均储存于Takara Bio Inc.)进行培养，并通过亚类检测确认，分别产生由γ2a和κ或bet188手机端λ链组成的H链和L链的单克隆抗体。总RNA由10^6.使用固件RNA试剂盒（含量）的细胞（一10厘米），得到〜70μg。

根据NCBI核苷酸数据库中所有小鼠IgG类的序列，设计H、L (κ)或L (λ)链的RT引物和RACE PCR的反引物(5 ' -RACE引物)。按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit的程序，以500ng总RNA为模板合成第一链cDNA。每个样品同时进行两个逆转录反应，分别使用H链和L链的RT引物。

1μl.		总RNA（500ng /μl）
1μl.		RT底漆（12 pmol/µl）
1.75µl		去离子的H2O.
3.75μl.		全部的

将这些反应混合物在72℃温育3分钟，然后进行42℃，持续2分钟以使RNA变性。然后加入1μl的更柔滑II寡核苷酸（12μm）并混合，总体积为4.75μL。为每个cDNA合成反应制备主混合物（如下所示）。

2μl.		5x第一股​​缓冲液
1μl.		德勤(20毫米)
1μl.		dNTP Mix (10mm)
0.25µl		核糖核酸酶抑制剂（40 U/µl）
1μl.		SMARTScribe逆转录酶(100u /µl)
5.25µl		全部的

10µl		5X PrimeSTAR Buffer (Mg2+）
4μl.		dNTP混合物（2.5毫米）
2.5µl		第一链cDNA
5μl.		10倍UPM（通用底漆A混合物）
1μl.		5 ' -RACE引物(10pmol /µl)
0.5µl		樱草颗HS DNA聚合酶（2.5 U /μL）
27μl.		H2O.
50µl		>总

热循环仪计划设置如下：

94℃		10秒
30个周期
98℃		10秒
60℃		5秒
72℃		1分钟
72℃		3分钟

5 ' -RACE PCR扩增产物经部分反应混合物琼脂糖凝胶电泳(使用2% NuSieve 3:1琼脂糖)确认。产品克隆到pUC118使用强大的克隆试剂套装（钝端）并通过桑格测序进行分析。以上实验是用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit和其他一些产品进行的。smart RACE 5 ' /3 '试剂盒包含RACE PCR的所有必要成分:

访问产品页面，了解更多有关SMARTer RACE 5′/3′套件的信息