单克隆抗体已广泛用于各种研究和诊断目标，其中严格的抗原特异性是一个关键的关键点。另外，由于抗体工程（例如，嵌合和人源化抗体的发展）的组合和抗体生产技术的改进技术，直接使用单克隆抗体作为治疗治疗变得更加可行。

因为抗体的抗原特异性由抗体的可变区的具体结构决定的，该区域的序列的分析是在许多应用中，包括抗体的产生在无动物成分的系统中，抗体作为药物的开发和生产的第一步的工程化抗体变体。使用SMART cDNA合成技术和简化方法，更胜一筹的RACE试剂盒提供了一种快速，简单的方法来分析这些变量的和重要的核苷酸序列。

对可变结构域的序列分析解

免疫系统产生10⁸来自外界的侵袭入侵物质的抗体品种。通过在显影淋巴细胞中发生的v（d）j重组来实现这种多样性。抗体分子具有重（H）和光（L）链组分，具有恒定和可变（V）区;v（d）J重组是与其他基因段的变量序列的几乎随机重排。该过程产生独特的抗原受体。由于它是H和L链的N-末端侧的可变区，其决定抗体 - 抗原亲和力，该区域的分析具有很大的兴趣。

图1.碱性抗体结构。

在分析可变区时，设计通用的引物来扩增所有可能的抗体序列是非常困难的。H和L链上游5 '端固有的变异性导致低序列同源性。分析这些可变区域的有效方法是在可变区域下游的固定区域设计一个简并引物，该区域的序列相对保守。然后可以使用5 ' RACE (Rapid一个mplification的cDNAENds)方法，然后进行排序。智能RACE套件带来完整的5 '端信息和敏感性的这一过程。

在比赛中应用更胜一筹的技术优势

使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit，在反转录时将SMARTer II A寡核苷酸添加到cDNA的末端。这个过程包含了我们独特的SMART (年代有魅力的米助力一个在5 '末端RNATEmplate）技术，允许逆转录酶到达转录物的绝对5'末端。大多数其他Race-PCR方法不会捕获5'结束，因此错过了重要信息。此外，在5'末端添加智能序列使得能够使用该站点进行下游放大和克隆。优化智慧竞争组件和协议显着降低了非特定背景并提高放大效率。稳健的系统即使用基因组DNA污染的样品也能产生可靠的结果，并且适用于各种应用。用高保真聚合酶扩增cDNA片段确保有效分析所需的核苷酸序列的准确复制。

衍生自小鼠杂交瘤的抗体基因的快速克隆

为克隆小鼠杂交瘤抗体基因，根据NCBI数据库中所有小鼠IgG类的序列，设计了H、L (κ)或L (λ)链的反转录引物(RT引物)和RACE PCR反转录引物(5 ' -RACE引物)。利用SMARTer RACE方法从总RNA中合成第一链cDNA，然后直接进行5 ' -RACE PCR，不仅可以获得5 '末端序列，还可以获得包含可变区全长序列的cDNA片段。

图2.实验工作流程使用聪明RACE cDNA扩增试剂盒的抗体可变结构域的5'-RACE PCR。

对小鼠杂交瘤株进行培养，证实产生了H链和L链分别由γ2a和κ链组成的单克隆抗体。总RNA的制备作为smart RACE cDNA Amplification Kit的输入。对重(H)链和轻(L)链均按照推荐方案进行cDNA第一链合成和5 ' -RACE PCR，并对部分反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳确认扩增产物。

然后，我们对六种另外的杂交瘤菌菌株进行相同类型的可变抗体区域的基因序列分析。PCR产物由所有抗体亚类获得。序列分析表明，90％的H克隆克隆和50％的L链克隆用于其各自的靶抗体蛋白的N-末端氨基酸序列精确编码。

图4。小鼠各亚类抗体基因的扩增．

在少数情况下，克隆对靶抗体具有序列同源性，但由于在其序列中存在止乳密码子存在而不太可能编码功能抗体。此外，我们怀疑一种特定的克隆含有来自用于细胞融合的骨髓瘤细胞的转录物，因为序列是从多个杂交瘤中获得的。一些杂交瘤与这种常见的序列产生更多的克隆，而不是靶单克隆抗体的序列编码。基于这些结果，显然应与DNA序列分析并联分析并确认靶抗体的N-末端氨基酸序列。

进一步的改进更聪明RACE cDNA合成，包括简化的克隆

在努力提升RACE程序，我们最近作出显著更新我们更胜一筹的RACE试剂盒。上面示出的数据用更聪明的RACE cDNA扩增试剂盒获得的，在具有用PrimeSTAR HS DNA聚合酶进行PCR，并且Mighty克隆试剂组（平端），用于连接克隆结合。从那时起，我们已经开发了智能RACE 5 ' /3 '套件，拥有同样独特的smart核心技术的完整系统，加上进一步的改进在反应条件和下游克隆中。

新的试剂盒包含了进行SMARTer RACE实验所需的所有组件(除了基因特异性引物)。通过将SMARTer II A寡核苷酸与SMARTScribe逆转录酶配对，它提供了高敏感性和特异性，以及低本底。SeqAmp DNA聚合酶提供了强大的PCR性能，在扩增长或富含gc的挑战性目标时尤其有用。

smart RACE 5 ' /3 '套件的关键组件是融合高清克隆试剂盒，这允许容易，准确地克隆5'-比赛片段，而不使用连接酶。在试剂盒中提供了一种与融合技术兼容的线性化载体，并且附带的引物专门设计用于匹配该载体。融合克隆方法是高效且适合于所有克隆应用。通过将这项技术与良好的智能竞争方法配对，从RNA到准备分析的克隆只需要两天时间。

SMARTer RACE cDNA合成为抗体可变域的全长序列分析提供了一种敏感的、流线型的解决方案。这些可变区域的多样性，虽然对有效的免疫反应至关重要，但对研究人员提出了一个挑战，希望分析这些基因片段进行广泛的研究，包括药物开发。有了这个序列，就有可能改良抗体在活的有机体内稳定性，具有改善的亲和力，或具有双重特异性。评估抗体可变区是这些和许多其他抗体修饰的第一步，而SMARTer 5 ' -RACE PCR是克隆这些目标进行测序的有效方法。

将7株小鼠杂交瘤菌株(均储存于Takara Bio Inc.)进行培养，并通过亚类检测确认，分别产生由γ2a和κ或bet188手机端λ链组成的H链和L链的单克隆抗体。总RNA由10⁶使用固件RNA试剂盒（含量）的细胞（一10厘米），得到〜70μg。

根据NCBI核苷酸数据库中所有小鼠IgG类的序列，设计H、L (κ)或L (λ)链的RT引物和RACE PCR的反引物(5 ' -RACE引物)。按照SMARTer RACE cDNA Amplification Kit的程序，以500ng总RNA为模板合成第一链cDNA。每个样品同时进行两个逆转录反应，分别使用H链和L链的RT引物。

1µl		总RNA (500 ng/µl)
1µl		Rt引物（12pmol /μl）
1.75µl		去离子的H2O
3.75微升		全部的

将这些反应混合物在72℃温育3分钟，然后进行42℃，持续2分钟以使RNA变性。然后加入1μl的更柔滑II寡核苷酸（12μm）并混合，总体积为4.75μL。为每个cDNA合成反应制备主混合物（如下所示）。

2µl		5 x第一链缓冲区
1µl		德勤(20毫米)
1µl		dNTP Mix (10mm)
0.25μl.		RNase抑制剂（40u /μl）
1µl		SMARTScribe逆转录酶(100u /µl)
5.25µl		全部的

10µl		5X PrimeSTAR Buffer (Mg2+）
4微升		DNTP混合物（2.5毫米）
2.5µl		第一链cDNA
5μl.		10x upm（通用底漆混合）
1µl		5 ' -RACE引物(10pmol /µl)
0.5µl		用PrimeSTAR HS DNA聚合酶（2.5单位/微升）
27µl		H2O
50µl		>总

热循环仪计划设置如下：

94℃		10秒
30个周期
98°C		10秒
60℃		5秒
72℃		1分钟
72℃		3分钟

5 ' -RACE PCR扩增产物经部分反应混合物琼脂糖凝胶电泳(使用2% NuSieve 3:1琼脂糖)确认。产品克隆到pUC118使用强大的克隆试剂套装（钝端）并通过桑格测序进行分析。以上实验是用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit和其他一些产品进行的。smart RACE 5 ' /3 '试剂盒包含RACE PCR的所有必要成分:

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