常见问题

对于许多样本的高通量分析或稀有转录物的精确检测，建议采用一步RT-qPCR方案。一步RT-PCR的另一个优点是存在单管工作流程，避免了在程序中途添加额外试剂的需要，从而降低了污染风险。

有关更多信息，请查看我们的BioView博客帖子“选择正确协议的一步与两步RT qPCR技巧".

RT-qPCR的校准曲线可通过以下任一方法制备:

1. 连续稀释RNA，然后进行逆转录和实时PCR
2. 连续稀释cDNA（通过逆转录反应获得），然后进行实时PCR

由于这两种方法评估的参数不同，因此选择一种适合所使用的实验系统的方法是很重要的。从稀释后的RNA样品中得到的校准曲线不仅反映了PCR扩增效率的差异，还反映了反转录效率的差异，而反转录效率的差异取决于RNA的数量。根据这种校准曲线确定的PCR扩增效率可能与实际效率存在潜在的差异。

对于绝对定量而言，反转录效率至关重要。因此，使用连续稀释的RNA制备校准曲线（cDNA稀释不合适）。

对于相对定量，反转录效率的差异可以通过检测内参基因(如管家基因)来纠正。建议使用连续稀释的cDNA来制备校准曲线。

为避免总RNA样本中基因组DNA的扩增:

• 设计避免基因组扩增的引物：选择一个大的内含子区域，并在内含子上游和下游的外显子中设计正向和反向引物。通过这种策略，大的内含子不能进行基因组扩增。当内含子很小时，可以根据熔化温度的差异来区分基因组扩增不同放大倍数的结果（熔融曲线）。
• 对于缺乏内含子或基因组结构未知的基因，用DNA酶I处理总RNA以去除基因组DNA。
• 使用带gDNA橡皮擦的PrimeScript RT试剂盒（完美实时）（类别#RR047A）。该试剂盒中的gDNA橡皮在2分钟内去除基因组DNA，随后进行15分钟的逆转录反应。结果的cDNA可以使用Takara Bio进行扩增bet188手机端qPCR预混料.

没有一个单一的、普遍适用的管家基因适合在每个实验条件下进行精确的归一化，因为在使用的实验系统中选择表达水平不变化的管家基因是很重要的。过去常用的管家基因包括GAPDH和β-肌动蛋白;然而，近年来的报道表明，这些基因的表达也可能不同，取决于样本类型和/或实验条件。

使用多个管家基因进行正常化是目前最可靠的方法。在这种策略中，对多个管家基因的表达进行分析，并选择表现出最低水平变异的基因进行使用。已经开发了用于选择最佳校正基因的软件（例如geNorm和BestKeeper）。如果可用，也可以从微阵列或RNA-seq表达谱数据进行推断。

更多信息请参阅:J. Vandesompele，等（2002）通过对多个内部控制基因进行几何平均，实现实时定量RT-PCR数据的精确标准化。基因组生物学。3.(7): RESEARCH0034.1-11。

合适的标准样品是那些尽可能接近实际样品的标准样品。对于基因表达分析研究，使用从已知目的基因表达条件下收集的样品中制备的cDNA。对于基因组分析研究，使用基因组DNA。

不建议使用人工标准样品（如质粒DNA）。即使扩增子序列相同，模板组成的任何实质性差异都可能导致不同的PCR扩增效率（如基因组DNA与质粒DNA）。

当使用经过验证的引物时，以前的熔体曲线分析(Tm值)可以作为参考。如果Tm值与过去观察到的相同，则可以认为PCR产物与过去得到的相同。

然而，请记住，尽管相同的PCR产物将显示相同的Tm值，获得相同的Tm值独自一人不一定确认PCR产物完全相同。应使用独立的确认方法；首次使用引物时，请进行电泳以确认实时PCR扩增产物为预期大小。

所需的样本重复次数（n）因实验系统而异。原则上，当预计实验误差相对较大时，应使用较大数量的样本。

• 当用RT-qPCR分析基因表达时，为了确定生物变异的程度，可以制备多个生物副本和进行多个RNA提取。
• 对于qPCR来说，使用低水平的模板时，由于检测所需的周期数较高，预计会有更大的变异性。在这种情况下，使用更多的复制。

qPCR的灵敏度取决于实验条件，如使用的试剂和引物。适当设计的系统已证明能够检测到约10份模板。

Ct值可通过两种不同的方法确定：

1. 交叉点法将Ct值定义为放大曲线与阈值线的交叉点。
2. 二阶导数最大值法将Ct值定义为放大曲线（二阶微分曲线）二阶导数最大值的点。

后一种方法允许高度精确的分析，因为Ct值是通过设置一个阈值固定的，不受仪器特异性检测变异性的影响。

请注意，有些仪器系统不允许在交叉点法和二阶导数最大值法之间进行选择。

• 绝对量化使用具有已知拷贝数的标准样本确定目标的绝对数（即拷贝数）。
• 相对量化允许样本之间进行相对比较。

通常，使用相对定量法，为了校正(标准化)的目的，将被量化的靶基因和参考基因(例如，家政基因)同时进行测定。相对定量是指未知样本与对照样本在表达水平上的差异。