常见问题

对于大量样本的高通量分析或罕见转录本的精确检测，建议采用一步RT-qPCR方案。一步式RT-PCR的另一个优点是单管工作流程的存在，避免了在程序中途添加额外试剂的需要，从而降低了污染的风险。

欲了解更多信息，请查看我们的BioView博客。单步rt - qpcr与两步rt - qpcr选择正确方案的提示"．

RT-qPCR的校准曲线可通过以下任一方法制备:

1. 连续稀释RNA，然后进行逆转录和实时PCR
2. 连续稀释cDNA(逆转录反应获得)，然后real-time PCR

由于这两种方法评估的参数不同，因此选择适合所用实验系统的方法非常重要。从稀释的RNA样品制备的校准曲线不仅反映了PCR扩增效率的差异，而且还反映了反转录效率的差异，这取决于RNA的数量。根据此类校准曲线确定的PCR扩增效率可能与实际效率不同。

对于绝对定量，反转录效率是至关重要的。因此，使用连续稀释的RNA来制作校准曲线(cDNA稀释不合适)。

对于相对定量，反转录效率的差异可以通过检测内参基因(如管家基因)来纠正。建议使用连续稀释的cDNA来制备校准曲线。

为避免总RNA样本中的基因组DNA扩增：

• 设计避免基因组扩增的引物:选择较大的内含子区域，在内含子上游和下游的外显子中设计正向和反向引物。采用这种策略，大的内含子就不能进行基因组扩增。当内含子很小时，基因组扩增可以根据扩增大小不同的熔化温度(熔化曲线)来区分。
• 对于缺乏内含子或基因组结构未知的基因，将总RNA与DNase I进行治疗以除去基因组DNA。
• 使用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Cat。# RR047A)。该试剂盒中的gDNA橡皮在2分钟内去除基因组DNA，随后进行15分钟的逆转录反应。结果的cDNA可以使用Takara Bio进行扩增bet188手机端qPCR预混料．

没有单一的，普遍适用的家务基因，适用于每种实验条件的精确标准化，因为选择在所用实验系统中表达水平没有变化的内脏基因是重要的。过去使用的常见内政基因包括GAPDH和β-肌动蛋白;然而，近年来的报道表明这些基因的表达也可能根据样品类型和/或实验条件而变化。

使用多个内务基因进行规范化是目前最可靠的方法。在这个策略中，对多个管家基因的表达进行了分析，并选择了变异水平最低的基因进行使用。已开发了选择最佳基因进行校正的软件(如geNorm和BestKeeper)。如果可以，也可以从微阵列或RNA-seq表达谱数据中进行推断。

有关更多信息，请参阅：J.Vandesompele，et al。(2002)多个内控基因几何平均实时定量RT-PCR数据的精确归一化。基因组医学杂志。3.（7） ：Research 0034.1–11。

合适的标准样品是尽可能接近地近似实际样品的标准样品。对于基因表达分析研究，使用在已知靶基因的条件下收集的样品制备的cDNA。对于基因组分析研究，使用基因组DNA。

不推荐人工标准样品(如质粒DNA)。即使扩增子的序列是相同的，模板组成中的任何实质性差异都可能导致可变的PCR扩增效率(例如，基因组DNA与质粒DNA)。

使用经验证的底漆时，先前的熔融曲线分析（Tm值）可作为参考。如果Tm值与过去观察到的值相同，则可以合理地假设PCR产物与过去获得的产物相同。

然而，请记住，尽管相同的PCR产物将显示相同的Tm值，但获得相同的Tm值独自的并不一定能证实PCR产物是相同的。采用独立的确认方法;第一次使用引物时，请进行电泳，确认real-time PCR扩增产物为预期大小。

必要的样品重复次数(n)随实验系统的不同而不同。原则上，当预期实验误差比较大时，使用较多的样本。

• 当用RT-qPCR分析基因表达时，为了确定生物变异的程度，可以制备多个生物副本和进行多个RNA提取。
• 就qPCR而言，当使用低水平的模板时，预计会有更大的可变性，因为检测所需的周期数将很高。在这种情况下，使用更多的复制品。

qPCR的灵敏度取决于实验条件，如使用的试剂和引物。适当设计的系统已经证明了检测大约10个模板副本的能力。

Ct值可以通过两种不同的方法确定:

1. 交叉点法将Ct值定义为放大曲线和阈值线之间的交叉点。
2. 二阶导数极值法将Ct值定义为放大曲线(二阶微分曲线)二阶导数极值点。

后一种方法允许高度精确的分析，因为Ct值是通过设置一个阈值固定的，不受仪器特异性检测变异性的影响。

请注意，某些仪器系统不允许在交叉点法和二阶导数最大值法之间进行选择。

• 绝对定量使用具有已知副本数量的标准样品确定目标的绝对数量(即副本数量)。
• 相对定量允许样品之间的相对比较。

通常，使用相对量化，同时分析待量化的目标基因和参考基因（例如，管家基因）以进行校正（标准化）。相对定量提供未知样本与对照样本表达水平的差异。