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在线研讨会网络研讨会:CRISPR聚合sgRNA文库筛选

CRISPR筛选确定宿主因子

发现SARS-CoV-2发病的关键宿主因素,并确定新的治疗靶点

病毒学领域的CRISPR筛选非常适合于分析病毒-宿主相互作用;确定对病毒进入、复制和传播至关重要的宿主因素;以及识别和优先排序新的药物靶点。使用sgRNA文库进行基因组规模的CRISPR/Cas9敲除筛选可以帮助识别重要的宿主因素对疾病反应敏感。

这指南- CRISPR全基因组sgRNA文库系统是一个合并的慢病毒SGRNA文库,用于在人细胞系中进行表型敲除屏幕。该系统基于Brunello库(Doiond等人2016; Doiond等人2018),并含有超过76,000个指导RNA(SGRNA),靶向约19,000个基因,每种基因有四个高度活跃的指南,以及不准确的SGRNA控制。提供扩增的验证的文库作为即用型冻干的转染混合物提供,使高滴度的慢性病毒和基因组Crispr屏幕的设置(图1)。

全基因组sgRNA筛选

图1所示。使用Guide-it CRISPR全基因组sgRNA文库系统进行CRISPR/Cas9全基因组筛选。sgRNA文库系统以单管、冻干混合物的形式提供,其中包含sgRNA载体、Lenti-X包装质粒和Xfect转染试剂。该系统实现了一步高效方案,便于慢病毒生产和转染。

筛选后,下一代测序(NGS)分析可以执行,以确定感兴趣的候选基因指导 - IT CRISPR基因组SGRNA库NGS分析套件,其中包括从通过我们基因组SGRNA文库转导的细胞群中制备Illumina测序的NGS文库的必要引物和试剂。

质量控制以确保SGRNA表示

我们的图书馆已经精心制造,以确保适当的sgRNA代表。我们测量了sgRNA在这个过程中的每一个步骤:文库合成、扩增、病毒产生和靶细胞转导(图2)。

系统内的SGRNA表示

图2.指导 - IT CRISPR基因组SGRNA库系统中SGRNA的表示。小组A.质粒图书馆指导表示。将Brunello的SGRNA文库克隆到PLVXS-SGRNA-MCHERRY-HYG载体中并扩增。通过NGS验证质粒DNA文库中SGRNA的表示。图书馆内所有已所述SGRNA的> 90%的表示在10倍的分布范围内。条形图表示具有特定读数的SGRNA数。面板B.指南在质粒库和转导细胞中的表达比较。从Cas9 + / SGRNA + A375细胞中分离出基因组DNA,然后在潮霉素中选择,然后PCR扩增。对PCR产物进行测序,以确定每个整合的sgRNA相对于起始质粒DNA群体的读计数。我们观察了强大的矛曼和皮尔逊相关性,表明该系统能够在转导和所选细胞群中保持SGRNA表示。

猫# 产品 尺寸 执照 数量 细节
632651 guideit™CRISPR全基因组文库PCR试剂盒 20 Rxns *

该指南 - IT Crisp基因组图书馆PCR试剂盒专为使用指导 - IT CRISPR基因组SGRNA文库系统(猫群)从细胞群中筛选的NGS文库制备。作为指导的一部分,也销售 -它Crispr基因组宽SGRNA库NGS分析套件(猫#632647)。该试剂盒含有扩增来自筛选细胞群的普通SGRNA序列所需的所有引物和试剂,用于通过NGS分析。该试剂盒包括足够的试剂用于进行20个PCR。

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我们的产品将用于研究只使用。它们不得用于任何其他目的,包括但不限于用于人类,治疗或诊断使用,或任何类型的商业用途。我们的产品可能不会转移到第三方,转售,修改转售,或用于制造商业产品,或者在未经证实的书面批准的情况下为第三方提供服务。

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632651:指南 - IT CRISPR基因组 - 范围内图书馆PCR套件

632651:指南 -  IT CRISPR基因组 - 范围内图书馆PCR套件
632647 Guide-IT™CRISPR基因组SGRNA库NGS分析套件 10 Rxns *

指导 - IT CRISPR基因组宽的SGRNA库NGS分析试剂盒可以使用指导 - IT CRISPR基因组SGRNA库系统(CAT。#632646)来制备从细胞群中筛选的下一代测序(NGS)文库,允许识别在筛选条件下,SGRNA序列和相应的基因敲除在频率下增加或减少。该试剂盒提供制备十种测序文库(20PCR)所需的所有组分,包括基因组DNA纯化试剂盒,引物,PCR酶和缓冲剂,以及PCR清理试剂盒。

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在指南- CRISPR全基因组sgRNA文库系统中sgRNA的表示

在指南- CRISPR全基因组sgRNA文库系统中sgRNA的表示

在指南- CRISPR全基因组sgRNA文库系统中sgRNA的表示。小组A.质粒图书馆指导表示。将Brunello的SGRNA文库克隆到PLVXS-SGRNA-MCHERRY-HYG载体中并扩增。通过NGS验证质粒DNA文库中SGRNA的表示。图书馆内所有已所述SGRNA的> 90%的表示在10倍的分布范围内。条形图表示具有特定读数的SGRNA数。面板B.指南在质粒库和转导细胞中的表达比较。用潮霉素筛选Cas9+/sgRNA+ A375细胞,并进行PCR扩增。对PCR产物进行测序,以确定每个整合的sgRNA相对于起始质粒DNA群体的读计数。我们观察到很强的Spearman和Pearson相关性,这表明该系统能够在转导和选择的细胞群体中保持sgRNA的代表性。

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6-硫鸟嘌呤筛选后从细胞中分离的sgrna的鉴定和分析

6-硫鸟嘌呤筛选后从细胞中分离的sgrna的鉴定和分析

6-硫町(6-TG)筛选后细胞分离的SGRNA鉴定及分析。小组A.比较SGRNA表示与用于制备慢病毒制剂的原始质粒库群和所得转导,所选和未选择的细胞群之间的比较。所有四个sgrnas for产生HPRT(红点)NUDT5(黑点)富集在6 TG选定的人群(蓝点)中。还显示了这些SGRNA在质粒文库(灰色)和转导的非选定群体(橙色)的表示。面板B.选择后,sgRNA的表达响应(蓝色)转移到6-TG。在这种相关性中,富集的单个sgrna被突出显示(红点和橙点)。插图显示了四种sgrna的折叠富集产生HPRT基因与未选定的人群相比。

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使用6-Thioguanine(6-TG)选择的SGRNA库屏幕的工作流程原理图

使用6-Thioguanine(6-TG)选择的SGRNA库屏幕的工作流程原理图
使用6-硫鸟嘌呤(6-TG)筛选sgRNA文库的工作流程示意图。Cas9+ A375细胞经sgRNA文库转导、湿霉素筛选和扩增后,分成两个群体。部分Cas9+/sgRNA+细胞群暴露于6-TG,而对照细胞群在正常培养条件下扩大,不添加6-TG。扩增两个细胞群体后,收集基因组DNA,并准备用Guide-it CRISPR全基因组sgRNA文库NGS分析试剂盒进行测序。

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使用MCHERRY荧光测定SGRNA文库Lentivirus的转导效率

使用MCHERRY荧光测定SGRNA文库Lentivirus的转导效率

用麦克里荧光测定SGRNA文库慢病毒的转导效率。包含sgRNA库的慢病毒是按照用户手册中的说明生产的。48小时后收获慢病毒,用于在不同的MOIs上转导表达cas9的A375细胞。48小时后,将转导的细胞镀上,用荧光显微镜和流式细胞仪分析转导效率。

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在Guide-it CRISPR sgRNA库中使用的载体和sgRNA支架设计

在Guide-it CRISPR sgRNA库中使用的载体和sgRNA支架设计

指南it CRISPR sgRNA库中使用的载体和sgRNA支架设计。pLVXS-EF1a-Cas9-PGK-Puro和pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体图谱显示慢病毒载体主干。载体是自失活的,以提高生产和使用期间的安全性。pLVXS sgRNA McHery hyg载体包含从IRES连接的双顺反子表达盒表达的McHery和潮霉素标记。sgRNAs由人U6启动子表达,并含有优化的支架序列,以提高Cas9的装载和编辑效率(B组)。

632646 引导它™ CRISPR全基因组sgRNA文库系统 5个屏幕

许可声明

身份证号码
396 Sigma-Aldrich CRISPR使用许可协议本产品及其使用是以下一项或多项已发布专利和专利申请的主题:澳大利亚专利号2013355214;2017204031; 和2018229489;加拿大专利号2891347和2977152;中国专利号CN105142669;欧洲专利号EP 2 928 496 B1;EP 3 138 910 B1、3 138 911 B1、EP 3 138 912 B1、EP 3 360 964 B1、EP 3 363 902 B1;以色列专利号IL238856;新加坡专利号11201503824S;韩国专利号10-1844123和10-2006880;和美国专利申请序列号15/188911;15/188,924; 15/188,927; 15/188,931; 和15/456204(“专利权”)。根据本许可协议中规定的条件,购买本产品将向您(“买方”)转让将本产品用于许可研究用途(见下文定义)的不可转让权利。1.“许可研究用途”是指用于研究目的的任何用途,除非:(i)买方不得将产品(包括但不限于包含全部或部分产品的任何材料)或任何相关材料出售或以其他方式转让给任何其他第三方(除非您可以将产品或任何相关材料转让给真正的合作者或合同研究机构),或使用产品或任何相关材料为任何其他第三方的利益提供服务;(ii)买方只能使用购买的产品和产品组件的数量,并应使用任何相关材料,仅用于您在该领域内的内部研究,不得用于任何商业目的;(iii)买方应按照所有适用法律法规使用产品和任何相关材料,包括但不限于适用的人类健康和动物福利法律法规;以及(iv)买方应对SIGMA及其现任和前任董事、高级职员、雇员和代理人及其各自的继承人、继承人和受让人(以下简称“赔偿”)的任何责任、损害、损失或费用(包括但不限于合理的律师费和费用)进行赔偿、辩护并使其免受损害因行使本协议项下授予买方的任何权利或买方违反本许可协议而产生的或与之相关的任何索赔、诉讼、调查、行动、要求或判决而招致或强加给任何受偿人。2.就上文第1节而言,以下定义应适用于:ly:“商业目的”是指(a)任何方法、过程或服务的实践、实施或提供,或(b)任何产品的制造、销售、使用、分销、处置或进口,在每种情况下(a)或(b)出于考虑,或基于任何其他商业基础指作为研究工具用于研究目的;但前提是,尽管有上述规定,该领域应明确排除(a)任何体内和体外人体或临床用途,包括但不限于任何人体给药或任何诊断或预后用途,(b)营利实体创建转基因啮齿动物模型和/或其衍生物(包括但不限于啮齿动物细胞和啮齿动物器官),(c)任何体内兽医或牲畜用途,或非研究性农业用途,或(d)用作人类或动物的测试服务、治疗或诊断。“相关材料”指产品的任何后代、修改或衍生产品。3.如果您未能遵守这些条款和条件,您使用本产品的权利将立即终止。在您的权利终止后,您应销毁您控制的所有产品、相关材料及其组件,并以书面形式通知SIGMA关于出于许可研究用途以外的目的购买本产品的许可证,请联系您当地的SIGMA销售代表,或致电+1 800-325-3010。
55 cPPT元素。本产品及其使用受以下一项或多项美国专利的约束。编号8093042和10407695以及国外同等产品。购买本产品向买方转让了不可转让的权利,即在买方进行的研究中使用购买的产品和产品组件(无论买方是学术实体还是营利实体)。买方不得向第三方披露信息、出售或以其他方式转让本产品、使用本产品或其组件制造的组件或材料,或将本产品或使用本产品或其组件制造的组件或材料用于任何商业目的。如果买方不愿意接受本有限使用声明的限制,Takara Bio USA,Inc.愿意接受退货并全额退款。有关购买DNA皮瓣技术用于研究以外目的的许可证的信息,请联系巴斯德研究所技术转让办公室,地址:巴黎西德15号,鲁博士街28号,75 724(www.Pasteur.fr)。188足彩网站bet188手机端
391 有限用途标签许可:仅用于研究该产品的许可证授予美国豆类生物从驯鹿生物科学公司及其子公司,Inc .)和本产品转移到终端用户购bet188手机端188足彩网站买者(“买方”)受到“有限使用标签许可证”输送买方有限,使用产品不可转让的权利,仅仅提供给买家,与(i)买方产生的产品的子代或衍生物(包括但不限于细胞),以及(ii)从产品或其相应子代或衍生物(包括但不限于细胞)中提取或衍生的生物材料(统称为产品,以及(i)和(ii)被称为“材料”)仅用于为买方的唯一利益进行内部研究。买方不得出售或以其他方式转让材料给第三方,或以其他方式将材料用于任何除外用途。“除外用途”指任何及所有:(a)商业活动,包括但不限于生产(包括但不限于用于生物生产的细胞系开发)、产品检测或质量控制的任何用途;(b)临床前或临床试验或其他旨在向美国食品和药物管理局或任何其他国家或司法管辖区的监管机构提交数据的活动,该等研究中的活性制剂包含该材料;(c)用于向第三方提供服务、信息或数据;(d)用于人类或动物治疗、诊断或预防的用途,或作为治疗、诊断或预防的产品;(e)农业田间试验活动或向美国农业部或任何其他农业监管机构提交数据的任何活动; (f) high throughput screening drug discovery purposes (i.e., the screening of more than 10,000 experiments per day) as well as scale-up production activities for commercialization; (g) modification of human germline, including editing of human embryo genomes (with the sole exception of editing human embryonic stem (ES) cell lines for research purposes) or reproductive cells; (h) self-editing; and/or (i) stimulation of biased inheritance of a particular gene or trait or set of genes or traits (“gene drive”). It is the Purchaser’s responsibility to use the Material in accordance with all applicable laws and regulations. For information on obtaining additional rights, including commercial rights, please contact licensing@cariboubio.com or Caribou Biosciences, Inc., 2929 7th Street, Suite 105, Berkeley, CA 94710 USA, Attn: Licensing.
89 本产品受美国专利9,945,850和其他正在申请的专利保护。欲了解更多授权信息,请通过电子邮件联系Takara Bio USA授权代表licensing@takbet188手机端arabio.com。
63 本产品的使用包括以下一个或多个美国专利号和相应的美国以外的专利要求:6,998,115;7427394年。本产品仅用于研究目的。不得用于(i)任何人类或兽医用途,包括但不限于治疗和预防用途,(ii)任何临床用途,包括但不限于诊断用途,(iii)筛选化学和/或生物化合物以鉴定药物活性制剂(包括但不限于小分子筛选)、目标验证、临床前测试服务或药物开发。在上述任何用途上使用本产品都需要获得麻省理工学院的许可。
272 本产品(“产品”)及其使用是美国专利8,697,359和8,771,945的主体,并正在申请美国专利。购买产品传达给买方不可转让的使用权(s)从豆类生物购买美国产品,公司或其附属公司,以及任何后代,修改或衍生品的产品,或通过使用或修改的任何细胞或动物的产品,或任何后代,188足彩网站bet188手机端该细胞或动物的修饰或衍生物(“相关材料”),仅用于买方按照以下所有要求进行的研究。没有权利将本产品或相关材料用于任何其他目的,包括但不限于用于药物、体外诊断目的、治疗或人体。买方不得出售或转让产品(包括但不限于任何材料,包含全部或部分的许可产品)或任何相关材料到任何其他个人或实体,或使用的产品或任何相关材料来执行服务,造福其他任何个人或实体,(2)买方应只使用购买的产品的产品和组件,并使用任何相关材料,仅为其内部研究和不是(a),性能或提供任何方法、过程或服务,或(b)制造、销售、使用、分配、性格或进口任何产品,在每种情况下(a)或(b)出于考虑,或基于任何其他商业基础(“商业目的”),(iii)买方应遵守所有适用法律和法规,包括但不限于适用的人类健康和动物福利法律和法规,使用许可产品和任何相关材料,以及(iv)买方应就MIT、Harvard和the Broad及其现任和前任受托人、董事、官员、教职员工、附属调查人员、学生、雇员和代理人及其各自的继承人、继承人和受让人(“受赔偿人”)的任何责任、损害、损失、或因行使授予买方的任何权利而产生的或与之相关的任何索赔、诉讼、调查、诉讼、要求或判决而由任何受赔偿方产生或强加于任何受赔偿方的费用(包括但不限于合理的律师费和开支),或违反买方在本协议项下授予的任何权利。
44 DSRED-单体和果实荧光蛋白由以下U.S.Patents中的一种或多种覆盖:7,005,511和7,393,923。
330 本产品是技术许可协议的主体,仅供内部研究使用。除研究用途外,使用本产品可能需要额外的许可证。有关许可限制或研究以外用途的信息可以通过联系licensing@takarabio.com获得。
72 生活颜色荧光蛋白质产品:

非营利性实体:可以通过与您的当地代表或Takara Bio USA, Inc.联系的正常方式下订单。188足彩网站bet188手机端客户服务。本产品的任何和所有使用将受非商业使用许可协议(“非商业许可”)的条款和条件的约束,该协议的副本可在下面找到。作为向您销售本产品的条件,在使用本产品之前,您必须同意非商业许可的条款和条件。根据非商业性许可,Takara Bio USA, Inc.授予非营利bet188手机端188足彩网站性实体非排他的、不可转让的、不可再许可的和有限的许可,仅将本产品用于内部的、非商业性的科学研究用途。该等许可明确排除了向第三方出售或以其他方式转让本产品、其组件或其衍生品的权利。未经Takara Bio USA, Inc.的明确书面许可,不得对产品进行任何修改。188足彩网站bet188手机端本产品的任何其他用途需要Takara Bio USA, Inc.的不同许可证。188足彩网站bet188手机端有关许可信息,请通过电话650.919.7320或电子邮件licensing@takarabio.com与许可代表联系。

对于希望使用本产品的营利实体,需要从Takara Bio USA,Inc.获得许可证。有关许可证信息,请通过电话650.919.7320或电子邮件650.919.7320与bet188手机端188足彩网站许可代表联系licensing@takarabio.com.

非营利性非商业性使用许可:
可以通过点击此处找到指南IT™CRISPR基因组范围内SGRNA库系统产品许可协议的副本。
406. 本产品是技术许可协议的主体,仅供内部研究使用。除研究用途外,使用本产品可能需要额外的许可证。有关许可限制或研究以外用途的信息可以通过联系licensing@takarabio.com获得。
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指导 - IT CRISPR基因组的SGRNA库系统包括在人细胞中进行五类基于慢病毒的基因组的基因组的基因组宽CRISPR / CAS9敲除截止所需的所有组分。随着试剂盒是慢病毒载体,用于表达Cas9和> 76,000 sgrnas靶向> 19,000个人基因(每种基因四个导轨),即冻干的即用转染的形式,简化了高滴度的慢性病毒的产生。本套件包括的SGRNA库基于Brunello库(Doiond等,2016),并包含旨在最大限度地提高目标功效并最小化偏离目标效果的设计特征。为确保平衡指南表示,我们通过NGS分析SGRNA库,以确认> 90%的包括SGRNA落在10倍的分布范围内。通过NGS与指导 - IT CRISPR基因组SGRNA文库NGS分析试剂盒(猫,可以通过NGS分析筛选细胞中SGRNA的富集或耗尽SGRNAS富集或耗尽。(猫#632647)。

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更多信息

使用基因组CRISPR屏幕进行病毒学的研究示例

Flint,M.一种基因组 - 宽的CRISPR筛网鉴定了N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶作为埃博拉病毒的潜在抗病毒靶标。Nat。通讯。285年,(2019).

盖布里,M。等等。病毒与宿主相互作用的CRISPR-Cas9遗传分析病毒10,55(2018)。

汉族,J.基因组宽CRISPR / CAS9屏幕识别对流感病毒复制至关重要的宿主因子。细胞代表。23,596 - 607(2018)。

李,B。等等。全基因组CRISPR筛选确定了甲型流感病毒感染的宿主依赖因素。Nat。通讯。11,164(2020)。

Marceau,C.D.通过基因组规模CRISPR筛查对黄病毒科宿主因子进行遗传解剖。本性535年,159-163(2016)。

全基因组CRISPR筛选确定了一组限制性的HIV宿主依赖因素。纳特·吉内特。49岁,193-203(2017)。

Puschnik,A。等等。一个CRISPR工具箱,用于研究病毒 - 主机交互。启Microbiol Nat。15,351 - 364(2017)。

参考文献

多恩奇,J.G。等等。优化的SGRNA设计,以最大化活动并最大限度地减少CRISPR-CAS9的偏离目标效果。生物科技Nat。》。34岁,184-191(2016年)。

多恩奇,J.G。等等。我准备好CRISPR了吗?基因筛选的用户指南。NAT。Rev. Genet。19,67 - 80(2018)。

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有关存储条件,产品组件和技术规范,请参阅产品的分析证书。请参阅套件组件列表以确定套件组件。分析证书和套件组件列表位于“文档”选项卡下。


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