CRISPR筛选确定宿主因子
发现对SARS-CoV-2发病机制至关重要的宿主因素并确定新的治疗靶点
病毒学领域的CRISPR筛选非常适合于分析病毒与宿主的相互作用;确定病毒进入、复制和传播的关键宿主因素;识别和优先考虑新的药物靶点。利用sgRNA文库进行基因组规模的CRISPR/Cas9敲除筛选可以帮助识别与疾病应答有关的重要宿主因子。
的Guide-it-CRISPR全基因组sgRNA文库系统是一个慢病毒sgRNA库，用于在人类细胞系中进行表型敲除筛选。该系统基于布鲁奈罗图书馆(Doench et al. 2016;Doench et al. 2018)，包含超过76000个导向rna (sgRNA)靶向约19000个基因，每个基因有4个高度活跃的导向rna，以及非靶向sgRNA对照。扩增的、经过验证的文库可作为一种随时可用的冻干转染混合物，使高滴度慢病毒的生产和全基因组CRISPR筛选的建立变得容易(图1)。
图1所示。使用Guide-it CRISPR全基因组sgRNA文库系统进行CRISPR/Cas9全基因组筛选。sgRNA文库系统是一个单管冻干混合物，包含sgRNA载体、lentix包装质粒和Xfect转染试剂。该系统使一步，高效率的协议容易慢病毒生产和转染。
在筛选后，新一代测序（NGS）可以进行分析，以确定使用的兴趣候选基因CRISPR全基因组sgRNA文库NGS分析试剂盒，其中包括必要的引物和试剂，用于从被我们的全基因组sgRNA文库转导的细胞群体中制备准备illumina测序的NGS文库。
质量控制以确保sgRNA的表达
我们的文库经过精心制作，以确保正确的sgRNA表达。我们在文库合成、扩增、病毒产生和靶细胞转导的每一步都测量了sgRNA表达（图2）。
图2。在指南- CRISPR全基因组sgRNA文库系统中sgRNA的表示。面板。指导质粒库中的表示法。将基于brunello的sgRNA文库克隆到pLVXS-sgRNA-mCherry-hyg载体中并进行扩增。质粒DNA库中sgrna的表达通过NGS进行验证。>占文库中所述sgrna的90%，其分布范围在10倍范围内。条形图表示具有特定读计数的sgrna的数量。面板B。指南在质粒库和转导细胞中的表达比较。从湿霉素筛选的Cas9+/sgRNA+ A375细胞中分离基因组DNA，进行PCR扩增。对PCR产物进行测序，以确定每个整合的sgRNA相对于起始质粒DNA群体的读计数。我们观察到很强的Spearman和Pearson相关性，表明该系统能够在转导和选择的细胞群体中保持sgRNA的代表性。
更多的信息
使用全基因组CRISPR筛选的病毒学研究实例
一项全基因组CRISPR筛选确定n -乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶为埃博拉病毒的潜在抗病毒靶点。Nat。通讯。285,（2019).
盖布里,M。et al。病毒与宿主相互作用的CRISPR-Cas9遗传分析病毒10，55(2018)。
全基因组CRISPR/Cas9筛选确定流感病毒复制必需的宿主因子。细胞代表．23，596–607 (2018).
李,B。et al。全基因组CRISPR筛选确定了甲型流感病毒感染的宿主依赖因素。Nat。通讯。11，164(2020)。
通过基因组规模CRISPR筛选黄病毒科宿主因子的遗传分析。自然535年,159 - 163(2016)。
全基因组CRISPR筛查确定了一组受限制的HIV宿主依赖因子。Nat,麝猫。49岁,193 - 203(2017)。
Puschnik, a S。et al。研究病毒与宿主相互作用的CRISPR工具箱。Nat.Rev.Microbiol。15，351–364 (2017).
参考
Doench, j·G。et al。优化sgRNA设计，使CRISPR-Cas9活性最大化，脱靶效应最小化。生物科技Nat。》。34，184 - 191(2016)。
Doench, j·G。et al。我准备好接受CRISPR了吗？基因筛查用户指南。Nat,启麝猫。19,67–80 (2018).
更多的产品信息
有关存储条件、产品部件、技术规格等信息，请参见产品分析证书。请参阅套件组件清单确定套件组件。分析证书和套件组件清单位于“文档”页签下。
寻找更多用于COVID-19研究的产品
188足彩网站
•美国/加拿大:+1.800.662.2566•亚太地区:+1.650.919.7300•欧洲:+33.(0)1.3904.6880•日本:+81.(0)77.565.6999
仅供研究使用。不用于诊断程序。©2021 Tbet188手机端akara Bio Inc.保留所有权利。所有商标均为Takara Bio Inc.或其在美国和/或其他国家的关bet188手机端联公司或其各自所有者的财产。某些商标可能不会在所有司法管辖区注册。其他产品、知识产权和限制使用信息可在takarabio.com上获得。
