CRISPR筛选确定宿主因子
发现SARS-CoV-2发病的关键宿主因素,并确定新的治疗靶点
病毒学领域的CRISPR筛选非常适合于分析病毒-宿主相互作用;确定对病毒进入、复制和传播至关重要的宿主因素;以及识别和优先排序新的药物靶点。使用sgRNA文库进行基因组规模的CRISPR/Cas9敲除筛选可以帮助识别重要的宿主因素对疾病反应敏感。
这指南- CRISPR全基因组sgRNA文库系统是一个合并的慢病毒SGRNA文库,用于在人细胞系中进行表型敲除屏幕。该系统基于Brunello库(Doiond等人2016; Doiond等人2018),并含有超过76,000个指导RNA(SGRNA),靶向约19,000个基因,每种基因有四个高度活跃的指南,以及不准确的SGRNA控制。提供扩增的验证的文库作为即用型冻干的转染混合物提供,使高滴度的慢性病毒和基因组Crispr屏幕的设置(图1)。
图1所示。使用Guide-it CRISPR全基因组sgRNA文库系统进行CRISPR/Cas9全基因组筛选。sgRNA文库系统以单管、冻干混合物的形式提供,其中包含sgRNA载体、Lenti-X包装质粒和Xfect转染试剂。该系统实现了一步高效方案,便于慢病毒生产和转染。
筛选后,下一代测序(NGS)分析可以执行,以确定感兴趣的候选基因指导 - IT CRISPR基因组SGRNA库NGS分析套件,其中包括从通过我们基因组SGRNA文库转导的细胞群中制备Illumina测序的NGS文库的必要引物和试剂。
质量控制以确保SGRNA表示
我们的图书馆已经精心制造,以确保适当的sgRNA代表。我们测量了sgRNA在这个过程中的每一个步骤:文库合成、扩增、病毒产生和靶细胞转导(图2)。
图2.指导 - IT CRISPR基因组SGRNA库系统中SGRNA的表示。小组A.质粒图书馆指导表示。将Brunello的SGRNA文库克隆到PLVXS-SGRNA-MCHERRY-HYG载体中并扩增。通过NGS验证质粒DNA文库中SGRNA的表示。图书馆内所有已所述SGRNA的> 90%的表示在10倍的分布范围内。条形图表示具有特定读数的SGRNA数。面板B.指南在质粒库和转导细胞中的表达比较。从Cas9 + / SGRNA + A375细胞中分离出基因组DNA,然后在潮霉素中选择,然后PCR扩增。对PCR产物进行测序,以确定每个整合的sgRNA相对于起始质粒DNA群体的读计数。我们观察了强大的矛曼和皮尔逊相关性,表明该系统能够在转导和所选细胞群中保持SGRNA表示。
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使用基因组CRISPR屏幕进行病毒学的研究示例
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参考文献
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